非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 - 猪传染病
时间:2019-10-04来源:未知 作者:admin点击:
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非洲猪瘟病毒（Africanswine fever virus，ASFV）是在细胞质内复制的双股大DNA病毒，为非洲病毒科、非洲病毒属的唯一成员。ASFV Georgia 2007/1分离株（ASFV-G）属于基因II型，基因组大小189 344 bp，表达166个开放阅读框。UK(DP96R)基因位于右侧可变区，在
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非洲猪瘟病毒（Africanswine fever virus，ASFV）是在细胞质内复制的双股大DNA病毒，为非洲病毒科、非洲病毒属的唯一成员。ASFV Georgia 2007/1分离株（ASFV-G）属于基因II型，基因组大小189 344 bp，表达166个开放阅读框。UK(DP96R)基因位于右侧可变区，在不同病毒毒株基因组中序列高度保守，属于病毒毒力基因，是导致家猪发病重要因素之一。
01、UK基因重组质粒的构建
根据ASFVGeorgia 2007/1 株 UK基因序列（GenBank登录号:FR682468.1）合成UK全基因，并连入pUC57-simple载体。以合成的pUC57-UK质粒为模板进行UK基因扩增。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在250～500 bp之间可见单一扩增条带（图1），条带大小与预期相符（UK:291 bp）。将PCR产物进行回收，经双酶切后与载体质粒pET-28a（+）连接并转化DH5Hα，挑取菌落进行菌液PCR鉴定后测序验证，测序正确后将重组质粒分别命名为pET-28a-UK、pEGFP-N1-UK。
02、DP96R蛋白的表达形式分析
将原核表达质粒pET-28a-UK转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落接种于卡那抗性的LB液体培养基中，37℃、220 r/min培养OD600至0.6~0.8时，加入终浓度为0.4mmol/L IPTG，分别在37℃培养5h或在16℃培养10 h后，4℃、12 000×g离心10 min，收集菌体沉淀。沉淀经PBS洗涤后，冰浴条件下进行超声破碎，12 000×g离心10 min后分别取上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果表明，IPTG浓度为0.4mmol/L时，在16℃诱导10 h或37℃诱导5 h后，pET-28a-UK样品中均出现1条明显的蛋白条带，大小约15 kDa，与预测的11kDa相差较大，这种差异可能与串联重复序列的存在而导致的异常凝胶迁移率有关，蛋白以可溶性表达为主，空载体pET-28a对照组及未诱导的pET-28a-UK菌液样品中均未出现对应条带（图2）。
03、DP96R蛋白纯化验证
将重组pET-28a-UK接种至2L卡那抗性LB液体培养基中，37℃、220 r/min培养OD600至0.6，加入终浓度为0.4mmol/L IPTG，16℃诱导10h后，4℃、12 000×g离心10 min，收集菌体，以PBS洗涤沉淀后再次重悬，冰浴条件下进行超声波破碎至溶液澄清。收集上清液经Ni亲和层析预装柱纯化，SDS-PAGE和Western blot结果表明，纯化后的DP96R蛋白条带较为单一(图3A、3B)。蛋白纯度达到90%以上，BCA法定量蛋白浓度为600 μg/mL，满足后期免疫要求。
04、DP96R蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
利用纯化的DP96R重组蛋白免疫新西兰大白兔，分别在14、28、38d采血，收集血清并进行间接ELISA检测。结果如图4所示，DP96R蛋白首次免疫后2周，抗体水平开始上升，加强免疫后2周抗体水平有显著提高，3次免疫后抗体维持在较高水平，而对照组3次免疫血清抗体检测均为阴性（OD450<0.10）。
05、DP96R蛋白多克隆抗体特异性分析与鉴定
为验证多克隆抗体的特异性，将pEGFP-N1-UK质粒和pEGFP-N1空载体分别转染293T细胞，进行免疫荧光实验(immunofluorescenceassay, IFA)和Western blot分析。IFA结果显示，DP96R蛋白多克隆抗体可特异性识别293T细胞中表达的DP96R蛋白，而与空白对照没有反应（图5）。DP96R蛋白多抗与EGFP抗体均可识别蛋白分子量大小约为40 kDa的特异性蛋白条带 (图6)。结果表明制备的抗DP96R蛋白的多克隆抗体具较好的反应性和特异性。
非洲猪瘟是世界动物卫生组织（Office internationaldes épizooties，OIE）法定报告的烈性传染病之一，我国将其列为动物一类传染病，至今仍无有效的商品化疫苗问世，给全球养殖业造成巨大的经济损失。现有ASF的防控方法主要是包括流行病学监测、划定疫区以及扑杀受感染动物等。目前，在ASF的疫苗研究中，缺失活病毒疫苗是研究重点。本研究针对ASFV Georgia 2007/1的UK基因，构建了含有His标签的重组原核表达质粒。在原核表达系统中，低温诱导时，DP96R蛋白主要呈可溶性表达，经纯化获得纯度＞90%的重组蛋白。Western blot和ELISA结果表明DP96R蛋白具有较好的反应原性，制备的多抗可用于Western blot检测和IFA检测，为进一步研究蛋白的生物学功能以及建立ASFV UK基因缺失毒株鉴别诊断方法奠定了基础。
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03、DP96R蛋白纯化验证
将重组pET-28a-UK接种至2L卡那抗性LB液体培养基中，37℃、220 r/min培养OD600至0.6，加入终浓度为0.4mmol/L IPTG，16℃诱导10h后，4℃、12 000×g离心10 min，收集菌体，以PBS洗涤沉淀后再次重悬，冰浴条件下进行超声波破碎至溶液澄清。收集上清液经Ni亲和层析预装柱纯化，SDS-PAGE和Western blot结果表明，纯化后的DP96R蛋白条带较为单一(图3A、3B)。蛋白纯度达到90%以上，BCA法定量蛋白浓度为600 μg/mL，满足后期免疫要求。
04、DP96R蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
利用纯化的DP96R重组蛋白免疫新西兰大白兔，分别在14、28、38d采血，收集血清并进行间接ELISA检测。结果如图4所示，DP96R蛋白首次免疫后2周，抗体水平开始上升，加强免疫后2周抗体水平有显著提高，3次免疫后抗体维持在较高水平，而对照组3次免疫血清抗体检测均为阴性（OD450<0.10）。
05、DP96R蛋白多克隆抗体特异性分析与鉴定
为验证多克隆抗体的特异性，将pEGFP-N1-UK质粒和pEGFP-N1空载体分别转染293T细胞，进行免疫荧光实验(immunofluorescenceassay, IFA)和Western blot分析。IFA结果显示，DP96R蛋白多克隆抗体可特异性识别293T细胞中表达的DP96R蛋白，而与空白对照没有反应（图5）。DP96R蛋白多抗与EGFP抗体均可识别蛋白分子量大小约为40 kDa的特异性蛋白条带 (图6)。结果表明制备的抗DP96R蛋白的多克隆抗体具较好的反应性和特异性。
非洲猪瘟是世界动物卫生组织（Office internationaldes épizooties，OIE）法定报告的烈性传染病之一，我国将其列为动物一类传染病，至今仍无有效的商品化疫苗问世，给全球养殖业造成巨大的经济损失。现有ASF的防控方法主要是包括流行病学监测、划定疫区以及扑杀受感染动物等。目前，在ASF的疫苗研究中，缺失活病毒疫苗是研究重点。本研究针对ASFV Georgia 2007/1的UK基因，构建了含有His标签的重组原核表达质粒。在原核表达系统中，低温诱导时，DP96R蛋白主要呈可溶性表达，经纯化获得纯度＞90%的重组蛋白。Western blot和ELISA结果表明DP96R蛋白具有较好的反应原性，制备的多抗可用于Western blot检测和IFA检测，为进一步研究蛋白的生物学功能以及建立ASFV UK基因缺失毒株鉴别诊断方法奠定了基础。