猪伪狂犬病净化究竟使用何种疫苗为好? - 猪病预防及治疗/养猪技
时间:2019-10-04来源:未知 作者:admin点击:
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伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的包括多种家畜和野生动物发病的一种烈性传染
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伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的包括多种家畜和野生动物发病的一种烈性传染病。伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科，甲型疱疹病毒亚科。感染性的病毒由四个不同的结构组成，分别是（图1）中央核芯由线状双链 DNA 组成，DNA 同附于其上的具有保护性的二十面体形状的衣壳共同构成核衣壳，由蛋白质构成间质嵌入衣壳中，最外层被由多种病毒糖蛋白组成的囊膜包裹。
1、了解伪狂犬病毒基因组结构及独立相关蛋白的功能
伪狂犬病毒基因组为双股DNA，大小为150kb，由长独特区(UL)和短独特区(US)以及US两侧的末端重复序列(TR)与内部重复序列(IR)所组成。目前已经知道成熟病毒粒子有50种蛋白质，已命名的有11种糖蛋白，其中与毒力有关的糖蛋白有gC、gD、gE、gl。此外，胸苷激酶(TK)、核苷酸还原酶(RR)、蛋白激酶(，PK)、碱性核酸外切酶(AN)和脱氧尿苷三磷3酸激酶(dUTPase)等几种酶也与病毒的毒力密切相关。毒力是决定病毒是否能引起动物发病、死亡的关键性因素，伪狂犬的毒力由多个基因决定，了解这些基因有助于我们研制出新型的伪狂犬疫苗，消除伪狂犬病的危害。这些基因主要功能如下。
2、TK基因的缺失到底有没有现实意义?
如表1所示，TK基因是与毒力相关的主基因之一，它与病毒的复制、潜伏感染有关。有研究表明，TK基因的缺失可使其对猪和反刍动物的毒力显著降低，同时潜伏感染能力也下降。因此TK基因的缺失苗成为人们研究的焦点，Kit于1948年利用BUK株确实TK基因内部148bp制成疫苗，该疫苗没有出现毒力回复现象，对猪提供了有效保护。国内1999年四川农业大学郭万柱等构建出Fa株TK基因缺失苗，接种小猪显示了很好的免疫效果。鉴于这些早期的研究成果，很多疫苗厂家都以TK基因缺失为基础研发新型疫苗，但是TK基因的缺失真的有现实意义吗？
虽然TK基因的缺失降低了病毒的毒力，科研院所及疫苗厂家以TK基因缺失研发的新型疫苗也显示出一定效果，但TK基因的缺失存在着一定病毒基因重组的风险，其免疫原性也会受到影响。最近有研究表明，某些弱毒疫苗会移植至免疫猪的隐性靶组织即三叉神经元，并通过与伪狂犬野毒的超感染竞争，从而阻断隐性感染的发生。研究还表明，缺失TK基因的弱毒苗在三叉神经节的移植能力几乎没有。而阻断和减少野毒潜伏性感染在伪狂犬病的防制中是至关重要的。
研究表明：单独通过基因工程手段造成TK基因缺失，其病毒的毒力还是存在一部分，对猪仍有一定的风险。而目前市面上安全有效的弱毒疫苗都是通过反复传代培养获得的，通过若干代的培养后病毒的毒力基因发生一些突变，大幅度降低了病毒的毒力，实践证明这样的自然传代方式才是安全有效的。仅仅通过基因工程手段敲掉TK基因，在临床应用上还是存在着一定的风险。
目前研发伪狂犬基因缺失苗主要目的是鉴别免疫猪和野毒感染猪，为净化猪场伪狂犬病提供一种监测手段。虽然接种TK基因缺失苗，猪能产生很强的抵抗伪狂犬强毒的攻击，但是因TK基因属于酶蛋白基因，在体内不可能产生相应的抗体，因此不能用血清学方法区别免疫接种猪与自然感染猪。
通过上述论证，可以看出以TK基因缺失来作为研发伪狂犬基因缺失苗基础并没有太多现实意义。
3、gE基因的缺失才具有现实意义。
如图1所示，gE基因也是伪狂犬病毒一个重要的毒力基因，在伪狂犬病毒向神经系统的扩散中起重要作用。研究发现，只要缺失了gE 5’端第125位的缬氨酸和第126位的半胱氨酸，伪狂犬病毒毒力就会大大降低且不影响其免疫原性。gE糖蛋白的N端33位到100位的氨基酸区段包含了主要抗原表位，缺失掉该段基因，在机体内就不能产生相应的杭体，这为区别野毒感染和疫苗接种提供了依据。
近几年来，gE基因缺失已经成为国内外研究焦点，Quint等对伪狂犬NIA-3株进行gE基因缺失，构建的伪狂犬突变株能明显降低对小鼠和10周龄仔猪的毒力，免疫猪能抵抗强毒的致死攻击。国内，四川农业大学成功构建出gE/gI基因缺失株，也显示出良好的免疫效果。国内外的大型动物疫苗公司也投入大量的人力、物力研发以gE基因缺失为基础的新型疫苗。
在猪场的常规免疫过程中，普通疫苗在接种后虽然能预防临床症状的出现，但不能防止强毒在被感染动物体内复制、排出。此时利用gE基因缺失疫苗免疫并结合gE-ELISA检测抗gE抗体来区分开接种血清阳性猪和野毒感染血清阳性猪。这种接种gE基因缺失疫苗结合鉴别性诊断能力，现在已成为在世界各国及地区推广的伪狂犬病消除计划的理论基础。所以研发以伪狂犬gE基因缺失为基础的疫苗更具有现实意义。
4、本文小结
综上所述，从阻断和减少野毒潜伏性感染、毒力减弱及野毒鉴别三个方面看，TK基因缺失来作为研发伪狂犬基因缺失苗基础没有太多现实意义。国内伪狂犬病的净化之路任重而道远，具有鉴别野毒能力的伪狂犬gE基因缺失苗的出现让我们看到了希望，然而TK基因缺失苗对于伪狂犬的净化起不到任何作用，在阻断和减少野毒潜伏性感染方面几乎没有作用，临床应用也存在一定风险。
目前猪场免疫伪狂犬疫苗较多使用基因缺失苗，但是基因缺失苗也有较多的分类，有单基因缺失的，也有多基因缺失的，猪场到底该使用哪种疫苗，这是目前争论较多的问题，怎样认识这个问题，不妨从以下几方面来分析：
1、多基因缺失苗不等于传统的多价苗
这是个常识问题，传统的多价苗是含有多种抗原成份，免疫后对猪提供更多的保护。多基因缺失苗则是缺失多个基因，减少了一些抗原成份。当然减少的这些抗原成份对总体的免疫效果影响不大。
2、基因缺失的目的要明确
基因缺失的目的主要是为了在实验室鉴别免疫猪和野毒感染猪，为根除伪狂犬病提供血清学监测依据。目前，世界上通用的还是gE单克隆抗体ELISA试剂盒，单基因缺失苗和多基因缺失苗都能通过此试剂盒达到鉴别目的，从这个意义上来说，两者其实没有任何区别。
3、免疫效力
到目前为止，还没有权威性的论著对单基因缺失苗和多基因缺失苗免疫效力之间的优劣做过评述，从我们所了解的各猪场实际应用情况看，二者对控制伪狂犬病均具有良好的效果。抗体水平的监测也没有发现二者之间存在差异。最近有研究表明，某些弱毒疫苗会移植至免疫猪的隐性靶组织即三叉神经元，并通过与伪狂犬野毒的超感染竞争，从而阻断隐性感染的发生。研究还表明，既缺失糖蛋白gE又缺失Tk基因的弱毒苗在三叉神经节的移植能力比较弱。而阻断和减少野毒潜伏性感染在伪狂犬病的防制中是至关重要的。
4、安全性
这是双方争论的焦点问题，主要是关于单基因缺失苗是否安全的争论。
基因缺失在减毒方面有一定作用，但显然非常有限，从免疫学角度来看，疫苗的减毒主要还是依赖于继代培养。目前世界上除伪狂犬病疫苗外，其它畜禽疫苗都没有缺失基因，其中家禽用疫苗有十多种，猪用疫苗有五、六种，人用疫苗有七、八种，如果说这些疫苗存在毒力返强或其它安全性问题，显然与事实不符。因此，不能因为某一种疫苗缺失基因，就过分夸大了基因缺失在安全性方面的作用，甚至把基因缺失的多少作为衡量疫苗安全性的依据。
从历史的角度看，单基因缺失疫苗（BarthaK-61株）是一个使用历史最长（1961年研制成功）、范围最广、数量最多的弱毒疫苗。世界上58年的应用实践已经表明：这是一个免疫力和安全性都很好的疫苗株。因此，不能因为多基因缺失苗（即同时缺失TK基因）强调其安全性，就反过来怀疑单基因缺失苗的安全性，这与思维逻辑不符，更与发生的事实不符。
从现实的角度看，单基因缺失苗仍然是世界范围内用于防制伪狂犬病的当家品种，在十分注重生物安全的欧美国家，生产和使用一种不安全的疫苗是令人难以想象的。
到目前为止，已有多家国外公司的Bartha株单基因缺失弱毒苗获得了我国农业部的批准注册，并被允许进口。我国也是一个越来越注重生物安全的国家，批准注册这类单基因缺失苗时，是从各个方面充分考虑、认证了其安全性因素，显然有关单基因缺失弱毒疫苗存在安全问题的说法也是不可信的。
扩展阅读：
德国是如何净化伪狂犬病的?
据欧盟统计局2018年3月1日发布的数据，生猪是欧盟地区饲养最多的牲畜，近40%的生猪产自西班牙和德国，分别为3010万头和2760万头。也就是说，德国是欧盟第二大养猪国，是当今世界继中国、美国、西班牙之后第四大养猪国，其猪肉出口最大目的地是中国，占出口总量的五分之一，2011年以来德国对华猪肉出口增长了9倍。
同为养猪大国，但德国从1989年正式开始猪伪狂犬病净化，到2003年宣布完成伪狂犬净化，他们是如何做到的？
截至2017年5月，德国有2.38万家养猪场，其中种猪场8500家。平均每家养猪场规模约1150头猪，存栏791.7万头仔猪和195.13万头种猪。这些猪场主要分布在德国西部、北部和南部，每百公顷养猪密度约150头。
由于猪伪狂犬病对动物健康和猪肉生产经济的影响很大，德国的猪伪狂犬病净化尝试自上个世纪70年代末就已开始，旨在努力为全国范围的猪伪狂犬病净化提供法律依据。1980年4月30日，德国颁布了《猪伪狂犬病控制条例》，将猪伪狂犬病作为报告性疾病需要政府管控措施。条例要求，对每一个伪狂犬病暴发案例和伪狂犬病疑似案例进行强制性报告，净化措施的重点是通过免疫伪狂犬灭活疫苗来降低经济损失，并于1983年开始使用耳标或纹身标记免疫过的猪只。通过这种方法，成功控制了伪狂犬病暴发的严重程度，但不能降低疾病发生率，并不是一个真正意义上的疾病净化方案。
猪伪狂犬病的暴发与流行导致了德国国际贸易的限制增加和巨大的经济损失。在德国，北威州的养猪场数量最多，生猪存栏720万头，存栏大于50头的猪场有7400家。北威州每年因伪狂犬病所导致的经济损失约2500万德国马克（合9216.25万元人民币）。这些因素促使德国不得不建立起全国性净化程序。
1989年是德国真正意义上国家净化行动的开始。国家净化程序的顺利实施得益于两个重要条件：一是德国有了gI缺失疫苗。20世纪80年代中期，德国有43款猪伪狂犬病疫苗注册，其中有40款为gI缺失疫苗，3款为全病毒疫苗，这些疫苗来自于12家生产企业；二是1990年东德和西德的统一。
按照德国国家净化程序要求，第一步，保护未免疫的无伪狂犬病猪群（或者官方确认无疑似感染）。这些猪群表现的特征是无临床症状、无猪伪狂犬病病毒特异性抗体、未接触过其他阳性猪；第二步则是达到免疫不感染和净化阶段。
为了达到猪群伪狂犬病净化的状态，净化程序设定了4个具体步骤：
第一步，使用gI缺失疫苗对所有猪只进行免疫和再次免疫，持续时间3年；
第二步，在前面的基础上，进行持续免疫，通过血清学检测控制种猪中的野毒抗体携带者，并屠宰gI抗体阳性猪。计划这个阶段持续时间为3年；
第三步进行持续疫苗免疫和血清学检测、屠宰gI抗体阳性猪、限制动物转移。目标是如果未检测到野毒抗体携带者，即表示建立了“官方确认无伪狂犬病疑似感染的免疫猪群”状态——即免疫不感染状态；
第四步，停止疫苗免疫，逐步屠宰gI抗体阳性猪，持续进行至少每年两次的集中血清学检测，若未检测到野毒抗体携带者或疑似伪狂犬猪只时，即确认维持“官方确认无伪狂犬病疑似感染的免疫猪群”状态。
1993年，德国明确了无伪狂犬病猪场的要求。要求包括：
第一，无临床症状；第二，对所有种猪进行gI抗体血清学检测，这其中，如果猪群是来自无阳性猪群，仅进行抽样调查即可；第三，在生猪出栏前六个月没有疑似疾病和疫病暴发。疾病的检测涵盖了种猪场和育肥场（要求95%置信度和20%疾病流行率）；第四，维持状态也有一定的要求，包括：无临床症状，每隔6个月对所有种猪进行gI抗体血清学检测。按照要求，每隔6个月检测一次所有种猪场，其检测数量是根据种猪场规模大小确定，最大检测量是30头母猪。
在这期间，根据流行病学情况，猪场的检测间隔可缩短至3个月或延长至12个月。对来自无阳性猪群的猪只，可以不进行检测。这其中德国对于种猪场的生产许可要求是：只有无伪狂犬病的种猪才可引入猪场，只有具有官方说明无伪狂犬病证书的猪才可以进行运输和转卖。
到1997年，德国对净化程序做了调整：第一，对种猪和生产母猪进行gI抗体检测，将净化程序从之前的每6个月改为每12个月进行一次。第二，对免疫后的猪只也不再进行标记。第三，如果猪场暴发疾病，猪只能转移到屠宰场或另一个育肥场，如果猪被转移，本场的其它猪需要进行两次免疫，并且这些猪只能从本猪场转移至屠宰场。
1997年，德国伪狂犬病检测涉及动物数2479.52万头，实际检测数205.88万头，其中阳性数量9548例，其中阳性种猪数量699例。到2002年，即德国宣布完成伪狂犬病净化的前一年，阳性动物数骤减到3例，其中阳性种猪为2例。
1991~1996年，德国国家净化项目合计花费4.807亿德国马克（约17.72亿元人民币），成本投入涉及疫苗免疫、实验室检测、淘汰屠宰三项。其中，1991~1993年德国支出成本年均为5810万德国马克（约2.14亿元人民币），1994年骤增至1.242亿德国马克（约4.58亿元人民币）。其中单实验室检测花费一项，前三年每年均在300万德国马克（约1105万人民币），自1994年陡增十倍，达到了3280万德国马克（约1.21亿元人民币）。为什么会如此悬殊？
按照德国国家净化要求，种猪每年进行3次灭活疫苗免疫，育肥猪在育肥期免疫一次弱毒活疫苗，包括血液样本采集。系统全群免疫3年后开始，种猪每年检测两次。在实验室检测花费方面，一开始花费较少，之后的花费就非常多，因为全群进行系统免疫三年后才开始进行检测，再加上第四年开始检测出很多阳性猪，大量屠宰阳性猪花费也较多。上述统计还只是德国净化成本的一个缩影，所有净化成本的支出一直延续到2003年。其中，欧洲经济共同体按照检测费用合理成本的50%进行，上限是242.91万德国马克（约895.24万元人民币），很显然，这远不够德国净化检测的开销。
自1989年德国猪伪狂犬病根除项目成立以来，疾病暴发数量稳步下降，从1990年的820个暴发病例（病毒检测）到2003年的0个病例，并保持至今。gE阳性动物百分率从1994年的8.14%下降至2003年的0%，并保持至今。血清阳性猪群百分率从1994年的17.1%下降至2002年的0.008%和2003年的0%，并保持至今。
1995~2003年，德国不同地区先后实现了猪伪狂犬病净化状态，从1995年先行净化的勃兰登堡、萨克森、图林根等州，到2003年养殖大州下萨克森州、北威州宣布完成净化，标志着德国全国性猪伪狂犬病净化全部完成。
即使是现在，德国全猪群大规模免疫也非常重要，虽然伪狂犬病净化了，德国目前仍保留有5款注册的猪伪狂犬病疫苗，这5款全部为gI缺失弱毒活疫苗，来自3家企业。一旦伪狂犬疾病再次暴发，还有疫苗可用。在净化过程中，标记伪狂犬疫苗（借助基因工程技术在病毒基因组中引入分子标记，以区别于野毒株的新一代重组活疫苗）是疾病净化中重要的工具。
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